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                            網(wǎng)站首頁技術(shù)中心 > 哺乳動(dòng)物蛋白抽提試劑盒說明書
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                            哺乳動(dòng)物蛋白抽提試劑盒說明書
                            更新時(shí)間:2020-09-14 點(diǎn)擊量:1389

                                                                                                                                                

                            哺乳動(dòng)物蛋白抽提試劑盒說明書

                             

                            Mammalian Protein Extraction Kit

                            貨號(hào): K0889   

                            保存:蛋白酶抑制劑混合物:-20℃

                               其它 組分:室溫   

                             

                            組分說明

                             

                             

                             

                            Catalog no.                     K0889      K0889A

                            Kit Size                       25  次      100  次

                            Mammalian Protein Extraction Reagent     25 ml        100 ml

                            蛋白酶抑制劑混合物                 250  μl       1 ml

                             

                             

                             

                             

                            產(chǎn)品簡介

                             

                                  哺乳動(dòng)物蛋白抽提試劑能夠快速,溫和,高效的裂解哺乳動(dòng)物細(xì)胞,有效提取細(xì)胞漿和細(xì)胞核蛋白。該試劑使用溫和配方保證所提取蛋白保持生物學(xué)活性并可應(yīng)用于多種蛋白分析試驗(yàn),如:報(bào)告基因和酶活性測定,免疫檢測,蛋白純化等。提取后蛋白可采用          BCA  法進(jìn)行蛋白定量分析。哺乳動(dòng)物蛋白抽提試劑盒中帶有蛋白酶抑制劑混合物,可有效避免蛋白提取過程中蛋白的降解。

                             

                            注意事項(xiàng)

                             

                             1. 本產(chǎn)品可有效裂解細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)的貼壁細(xì)胞(無需刮取)以及離心收集的懸浮細(xì)胞,較反復(fù)凍融或超聲法具有更高提取效率。但對(duì)于組織蛋白的抽提,建議使用組織蛋白抽提試劑(#K0004,#K0891)。

                             

                             2. 表一中所列的是貼壁細(xì)胞蛋白提取的J使用量,如果需要減少試劑用量從而獲得更高的蛋白濃度,建議首先刮取細(xì)胞。

                             

                             3. 對(duì)于離心獲得的細(xì)胞,如果丌知道細(xì)胞的體積,可以根據(jù)細(xì)胞數(shù)量估計(jì)抽提試劑的使用量。如2×106個(gè)Hela 細(xì)胞約重20 mg,需要加入200μl 抽提試劑,以此類推。

                             

                             4. 通過本產(chǎn)品提取的蛋白,可通過BCA法進(jìn)行蛋白定量分析。

                             

                            操作步驟        

                             ●  貼壁細(xì)胞蛋白抽提

                             1.  小心傾去貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)液。

                             2.  注意:如培養(yǎng)基中含有酚紅或其他可能影響試驗(yàn)結(jié)果的物質(zhì),請先使用PBS漂洗細(xì)胞。

                             3.  請?jiān)诘鞍壮樘崆叭〕鰧?shí)驗(yàn)所需蛋白抽提試劑進(jìn)行預(yù)冷, 按照1:99比例加入蛋白酶抑制劑混合物(例如990μl抽提試劑中加入10μl蛋白酶抑制劑混合物),使蛋白酶抑制劑混合物在抽提試劑中成1×工作液。

                             

                            注意:在進(jìn)行蛋白抽提前2-3分鐘內(nèi)加入蛋白酶抑制劑混合物。

                             4.  加入適量哺乳動(dòng)物蛋白抽提試劑,(在冰上用槍頭吹打貼壁細(xì)胞,將裂解液轉(zhuǎn)移至離心管中),冰上孵育20分鐘,讓細(xì)胞充分裂解(試劑使用量請參考附表1,冰上放置時(shí)間應(yīng)根據(jù)細(xì)胞類型丌同進(jìn)行調(diào)整)。

                             5.  14,000×g離心5-10分鐘。

                             6.  轉(zhuǎn)移上清液至新管中,用于進(jìn)一步分析。

                             ●  懸浮細(xì)胞蛋白提取

                             1. 將懸浮細(xì)胞2,500×g,離心10分鐘,棄去上清。

                             2. 可選步驟:漂洗。如培養(yǎng)基中含有酚紅或其他可能影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的物質(zhì),請使用PBS漂洗細(xì)胞。

                             3. 漂洗后的細(xì)胞懸浮液2,500×g,離心10min,棄去上清。

                             4. 請?jiān)诘鞍壮樘崆叭〕鰧?shí)驗(yàn)所需蛋白抽提試劑進(jìn)行預(yù)冷,                             按照1:99比例加入蛋白酶抑制劑混合物(例如990μl抽提試劑中加入10μl蛋白酶抑制劑混合物),使蛋白酶抑制劑混合物在抽提試劑中成1×工作液。

                             

                            注意:在進(jìn)行蛋白抽提前2-3分鐘內(nèi)加入蛋白酶抑制劑混合物。

                             5. 加入適量哺乳動(dòng)物蛋白抽提試劑,每100 mg (~100 µl)細(xì)胞至少加入1 ml哺乳動(dòng)物蛋白抽提試劑。如提取的樣本量較大,可首先使用抽提試劑總使用量的1/10重懸細(xì)胞沉淀,然后加入剩余抽提試劑。

                             6. 吹打均勻后,冰上放置20分鐘,讓細(xì)胞充分裂解(冰上放置時(shí)間應(yīng)根據(jù)細(xì)胞類型丌同進(jìn)行調(diào)整)。                                                 

                            7. 14,000×g離心15分鐘。

                            8. 轉(zhuǎn)移上清至新管中,進(jìn)行下一步分析。

                             注:每100 mg細(xì)胞約可提取到6 mg的總蛋白(細(xì)胞類型丌同略有差異)。                      

                            參考附表

                             

                                                                        表  1. 抽提試劑使用量推薦表

                                                                                      

                            細(xì)胞培養(yǎng)板類型或平皿類型                     抽提試劑使用量

                            100 mm                         500-1,000 µl

                            60 mm                           250-500 µl

                            6 孔培養(yǎng)板                         200-400 µl /孔

                            24 孔培養(yǎng)板                         100-200 µl /孔

                            96 孔培養(yǎng)板                          50-100 µl/孔

                             

                            * 對(duì)于  100 mm  培養(yǎng)板培養(yǎng)的107個(gè)細(xì)胞  (50 mg)可裂解獲得約3 mg 總蛋白(細(xì)胞類型不同略有差異)。            

                             

                             2. 常見問題及解決辦法

                                                                                      

                             1. 低提取率

                            可能原因:

                            a低蛋白表達(dá)量

                            b試劑使用量不夠

                            c試劑無法溶解細(xì)胞膜

                             

                            解決方法:

                            a優(yōu)化轉(zhuǎn)染系統(tǒng)

                            b增加抽提試劑使用量

                            c增加裂解時(shí)間或者加大晃動(dòng)幅度

                            2. 無法獲得膜蛋白  

                            可能原因:用哺乳動(dòng)物蛋白抽提試劑提取核/漿蛋白  

                            解決方法:使用真核細(xì)胞膜蛋白抽提試劑盒                                                                                                               

                             

                            實(shí)驗(yàn)代做服務(wù):

                            ELISA試劑盒免費(fèi)代檢測

                            CCK8檢測

                            HE染色

                            蛋白相互作用分析

                            Western Blot

                            免疫組化IHC染色

                            熒光定量PCR

                            動(dòng)物模型服務(wù)

                            流式細(xì)胞檢測

                            免疫熒光染色

                            激光共聚焦

                            DNA甲基化實(shí)驗(yàn)

                            石蠟/冰凍切片

                            透射電鏡服務(wù)

                            掃描電鏡實(shí)驗(yàn)

                            蛋白雙向(2-D)

                            動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

                            免疫共沉淀

                            原位雜交(FIsh)

                            蛋白質(zhì)純化

                            分子克隆和質(zhì)粒載體構(gòu)建服務(wù)

                            組蛋白甲基化磷酸化乙酰化

                             

                            蛋白雙向2D-WB

                             

                            藥理毒理動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

                             

                            番紅O固綠染色

                            明膠酶譜MMP

                            酶活性檢測

                            動(dòng)物造模/模型實(shí)驗(yàn)服務(wù)

                            滬公網(wǎng)安備 31011802001677號(hào)

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