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                            Ni瓊脂糖凝膠操作說明書
                            更新時(shí)間:2021-04-14 點(diǎn)擊量:2322

                            Ni瓊脂糖凝膠說明書

                            Ni-Agarose Resin for 6×His-Tagged Proteins 

                            目錄號(hào):  K0010       

                                存:  20%乙醇中          2-8℃保存 

                             

                            組分說明 

                             

                                                 Cat.No.        K0010A         K0010C

                                                 Volume           10ml         100ml

                             

                            產(chǎn)品簡(jiǎn)介

                             

                                  該鎳柱純化系統(tǒng)對(duì)6×His-tag 蛋白具有顯著特異吸附能力,能夠高效一步純化帶有 6 個(gè)組氨酸親和標(biāo)簽的蛋白。該系統(tǒng)具有4 個(gè) Ni2+ 螯合位點(diǎn),較只有3 個(gè)螯合位點(diǎn)的Ni-IDA 結(jié)合Ni2+更為牢固,有效防止純化過程中Ni2+脫落且增強(qiáng)對(duì)His 標(biāo)簽蛋白的結(jié)合能力,提高純化效率。較高的基團(tuán)密度,大大提高了蛋白載量。該系統(tǒng)在天然或變性條件下,對(duì)來源于各種表達(dá)系統(tǒng)(如桿狀病毒,哺乳細(xì)胞,酵母以及細(xì)菌)中的 His 標(biāo)簽蛋白,均有很好的純化效果。本產(chǎn)品已螯合鎳離子,可直接使用,方便,快捷。

                            支持物:CL-6B 瓊脂糖凝膠

                                  量:20-30mgHis標(biāo)簽蛋白/ml 填料

                                  徑:50-160μm

                             

                            注意事項(xiàng) 

                             

                             1. 緩沖液中不建議使用β-巰基乙醇、DTT EDTA

                             2. 整個(gè)純化過程中切忌凝膠脫水變干。

                             3. 為提高純化效率,首先確定BindingBuffer 和  ElutionBuffer 中咪唑的最-#佳使用濃度。可以使用線性或梯度濃度的咪唑(20-500mM)洗脫蛋白,并通過SDS-PAGE WesternBlotting 來檢測(cè)目的蛋白的純度。

                             4. 請(qǐng)使用高純度的試劑配制緩沖液,并通過0.45µm 過濾器過濾。為避免柱子被堵塞,建議將裂解液進(jìn)行離心,或者使用 0.45µm 過濾器過濾。

                             5. 柱再生時(shí),保證每步洗完后都要用足夠的去離子水沖洗至中性。

                             

                            操作步驟 

                             

                            組裝層析柱 

                             1. 將填料混勻后加入層析柱,室溫靜置10 分鐘,待凝膠與溶液分層后,把底部的出液口打開,讓乙醇通過重力作用緩慢流出。

                             

                             注意:(1)填料的上層是乙醇保護(hù)層,將填料和乙醇一起混勻,以每ml填料純化20-30mgHis標(biāo)簽蛋白計(jì)算,取需要的填料與乙醇的混合液加入層析柱。

                             

                            2)如果乙醇不流出,可以給柱子一個(gè)外力,例如用大拇指對(duì)柱口輕輕按壓一下,迫使乙醇流出。                                                        

                            3)本實(shí)驗(yàn)都是通過重力作用使溶液流出。

                             

                             2. 向裝填好的柱中加入5 倍柱體積的去離子水將乙醇沖洗干凈后,再用 10 倍柱體積的Binding Buffer  平衡柱子,平衡結(jié)束后即可上樣。

                             

                             注意:柱體積指的是填料的體積。

                             

                            可溶性蛋白的純化(SolubleBindingBufferSolubleElutionBuffer配方詳見附表1 

                             1.  收集菌體后,每100mg菌體(濕重)加入1-5 ml細(xì)菌裂解液,超聲裂解菌體。

                             2.  將菌體裂解液負(fù)載上柱,流速為10倍柱體積/小時(shí)。

                             3.  使用15倍柱體積的Soluble Binding Buffer沖洗柱子,收集流穿峰。

                             4.  使用5倍柱體積的Soluble Elution Buffer洗脫,收集洗脫峰。

                             5.  洗脫后,依次使用3倍柱體積的Soluble Binding Buffer5倍柱體積的去離子水洗滌柱子,再用3倍柱體積的20%乙醇平衡(乙醇要將填料浸沒),4℃保存。

                            II  包涵體蛋白的純化(InclusionBodyBindingBuffer InclusionBodyElutionBuffer配方詳見附表2 

                             1. 收集菌體后,每100mg菌體(濕重)加入1-5 ml  細(xì)菌裂解液,超聲裂解菌體。

                             2. 離心,棄上清,將沉淀重懸于Soluble Binding Buffer中(如有需要,可進(jìn)行超聲波處理,超聲前可加入1-5mM磷酸酶抑制劑混合物)。

                             3. 重復(fù)操作2,直至包涵體清洗干凈(呈較潔凈的乳白色狀)。

                             4. 將沉淀重懸于Inclusion BodyBinding Buffer中,冰浴1小時(shí),使包涵體溶解。

                             5. 10,000×g離心20分鐘,將上清以孔徑為0.45 μm的濾膜過濾。

                             6. 將蛋白溶液負(fù)載上柱,流速為10倍柱體積/小時(shí)。

                             7. 使用15倍柱體積的Inclusion BodyBinding Buffer沖洗柱子,收集流穿峰。

                             8. 使用5倍柱體積的Inclusion Body Elution Buffer洗脫,收集洗脫峰。

                             9. 洗脫后,依次使用3倍柱體積的Inclusion BodyBinding Buffer5倍柱體積的去離子水洗滌柱子,再用3倍柱體積的20%乙醇平衡(乙醇要將填料浸沒),4℃保存。

                             

                                 注意:在純化包涵體蛋白時(shí),所有緩沖液均含有變性劑,需要降低 BindingBuffer 中的咪唑濃度(5mM 或更低)。洗脫時(shí),若蛋白在較高pH下洗脫失敗,可以選用低 pH 緩沖液作為洗脫緩沖液(pH6.5pH5.9 pH4.5)。 柱再生 當(dāng)填料使用多次后,結(jié)合效率會(huì)有所下降(表現(xiàn)為流速變慢或填料失去藍(lán)綠色),可以用以下方法再生,提高填料的使用壽命和蛋白質(zhì)的結(jié)合效率。

                             1. 使用2 倍柱體積的6M  鹽酸胍沖洗后,使用3 倍柱體積的去離子水沖洗。

                             2. 使用 1 倍柱體積2% SDS 沖洗。

                             3. 依次使用 1 倍柱體積的25%50%75%5 倍柱體積100%乙醇沖洗,再依次使用 1 倍柱體積的75%50%25%的乙醇沖洗。

                             4. 使用 1 倍柱體積的去離子水沖洗。

                             5. 使用 5 倍柱體積含50 mM EDTA 緩沖液(PH8.0)沖洗。

                             6. 使用 3 倍柱體積去離子水,3 倍柱體積20%乙醇沖洗。

                             7. 4°C 保存。

                             

                             8. 再次使用前,需首先使用10 倍柱體積去離子水沖洗,然后使用5 個(gè)柱體積的      50 mM NiSO4再生,3 個(gè)柱體積的Binding Buffer   平衡。

                             1: 蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)  

                            (分子量由大到小分別為:90/66/45/27/  14.4kDa

                            2: 全菌裂解液

                             3: 流穿收集液

                             4: 洗脫收集液    

                            1(洗脫緩沖液,含     500mM   咪唑,收集第1 個(gè)柱體積)

                             5: 洗脫收集液

                            2(洗脫緩沖液,含 500mM 咪唑,收集第 2 個(gè)柱體積)

                             6: 洗脫收集液

                            3(洗脫緩沖液,含500mM咪唑,收集第3 個(gè)柱體積)

                            7: 洗脫收集液

                             4(洗脫緩沖液,含500mM 咪唑,收集第 4 個(gè)柱體積)

                             

                             附表 

                             

                             附表  1. 可溶性蛋白純化緩沖液配方

                                                                                     

                            成分                    Tris-HClPH7.9)   咪唑            NaCl

                             

                            SolubleBindingBuffer              20mM      10mM       0.5M

                             

                            SolubleElutionBuffer              20mM        500mM     0.5M

                            

                             

                                

                            附表  2. 包涵體蛋白純化緩沖液配方

                             成分                 Tris-HClPH7.9)    咪唑    NaCl     尿素/鹽酸胍

                             

                            InclusionBodyBindingBuffer      20mM     5mM  0.5M    8M/6M

                            InclusionBodyElutionBuffer       20mM   500mM   0.5M    8M/6M

                             

                                

                            實(shí)驗(yàn)代做服務(wù):

                            ELISA試劑盒免費(fèi)代檢測(cè)

                            CCK8檢測(cè)

                            HE染色

                            蛋白相互作用分析

                            Western Blot

                            免疫組化IHC染色

                            熒光定量PCR

                            動(dòng)物模型服務(wù)

                            流式細(xì)胞檢測(cè)

                            免疫熒光染色

                            激光共聚焦

                            DNA甲基化實(shí)驗(yàn)

                            石蠟/冰凍切片

                            透射電鏡服務(wù)

                            掃描電鏡實(shí)驗(yàn)

                            蛋白雙向(2-D)

                            動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

                            免疫共沉淀

                            原位雜交(FIsh

                            蛋白質(zhì)純化

                            分子克隆和質(zhì)粒載體構(gòu)建服務(wù)

                            組蛋白甲基化磷酸化乙酰化

                             

                            蛋白雙向2D-WB

                             

                            藥理毒理動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

                             

                            番紅O固綠染色

                            明膠酶譜MMP

                            酶活性檢測(cè)

                            動(dòng)物造模/模型實(shí)驗(yàn)服務(wù)

                             

                            

                             

                             

                             

                                                                                                           

                            滬公網(wǎng)安備 31011802001677號(hào)

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