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                            呋喃唑酮代謝物操作步驟
                            更新時間:2021-08-26 點(diǎn)擊量:1893

                            呋喃唑酮代謝物快速檢測試劑盒說明書

                            一、原理

                            本試劑盒采用間接競爭ELISA方法,在微孔條上預(yù)包被偶聯(lián)抗原,樣本中的殘留物呋喃唑酮代謝物將和微孔條上預(yù)包被的偶聯(lián)抗原競爭抗呋喃唑酮代謝物抗體,加入酶標(biāo)記物后,用TMB底物顯色,樣本吸光值與其所含殘留物呋喃唑酮代謝物的含量成負(fù)相關(guān),與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出相應(yīng)殘留物呋喃唑酮代謝物的含量。

                            二、試劑盒特性

                            試劑盒靈敏度:   0.01ppb

                            孵育溫度:       25

                            孵育時間:       30min~15min

                            樣本檢測下限

                            肌肉組織   ·································   0.05ppb

                            雞蛋    ·······································  0.05ppb

                            蜂蜜   ·········································  0.05ppb 

                            交叉反應(yīng)率

                            呋喃唑酮代謝物 ·································  100%

                            呋喃酮代謝物 ·······························  0.1%

                            呋喃妥因代謝物 ·······························  0.1%

                            呋喃西林代謝物 ·······························  0.1%

                            樣本回收率

                            肌肉組織   ·································  95%±25%

                            雞蛋    ······································  9525%

                            蜂蜜   ·······································  8523%

                            三、試劑盒組成

                            1

                            微量測試孔

                            每條8孔,一板12

                            2

                            標(biāo)準(zhǔn)液×6

                            1ml/瓶)

                            0ppb

                            0.01ppb

                            0.03ppb

                            0.09ppb

                            0.27ppb

                            0.81ppb

                            3

                            酶標(biāo)記物

                            7ml

                            紅色帽

                            4

                            抗體工作液

                            7ml

                            藍(lán)色帽

                            5

                            底物A

                            7ml

                            白色帽

                            6

                            底物B

                            7ml

                            黑色帽

                            7

                            終止液

                            7ml

                            黃色帽

                            8

                            20X濃縮洗滌液

                            40ml

                            白色帽

                            9

                            2X濃縮復(fù)溶液

                            50ml

                            透明帽

                            10

                            衍生化試劑

                            10ml

                            白色

                            四、所用儀器、試劑

                            具備的儀器:酶標(biāo)儀、均質(zhì)器、振蕩器、離心機(jī)、刻度移液管、天平(感量0.01g)、氮吹儀、恒溫箱、恒溫水浴鍋

                            微量移液器:單道 20~200µl、單道100~1000µl、多道 30~300 µl

                                 劑:氫氧化鈉、K2HPO4·3H2O、正己烷、乙酸乙酯、濃HCl

                            五、樣本前處理步驟

                            樣本處理前須知

                            a)實(shí)驗(yàn)中必須使用一次性吸頭,吸取不同試劑時要更換吸頭。

                            b)實(shí)驗(yàn)之前須檢查各種實(shí)驗(yàn)器具是否干凈,必要時可對實(shí)驗(yàn)器具進(jìn)行清潔,以避免污染干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

                            樣本前處理需配制

                            配液1  0.1M K2HPO4溶液:

                            11.4g K2HPO4·3H2O加去離子水溶解定溶至500ml

                            配液2  1M HCl 溶液:

                            8.6mlHCl加去離子水定容至100ml

                            配液3  1M NaOH溶液:

                            4g NaOH加去離子水定容至100ml

                            配液4  樣本復(fù)溶液:

                            2X濃縮復(fù)溶液用去離子水按11稀釋。

                            樣本處理

                            a)肌肉、雞蛋樣本處理方法

                            1±0.05g的均質(zhì)物,分別加入4ml的蒸餾水,0.5ml 1M HCl溶液和100µl衍生化試劑,充分振蕩2min

                            37過夜孵育(大約16h)或56水浴中孵育(2h)

                            分別加入5ml 0.1M K2HPO4溶液,0.4ml 1M NaOH溶液和6ml乙酸乙酯,充分振蕩30s

                            在室溫下(20-254000r/min以上離心10min如出現(xiàn)乳化現(xiàn)象或乙酸乙酯層不足 3ml ,在 80  水浴孵育樣品10min 并重復(fù)離心;或提高轉(zhuǎn)速和延長離心時間重復(fù)離心);

                            取出3ml的乙酸乙酯到另一個容器中于50氮?dú)?/span>/空氣吹干。

                            2ml正己烷溶解干燥物,再加入1ml樣本復(fù)溶液充分混合30s;在室溫下4000r/min以上離心10min;去除上層正己烷相(如出現(xiàn)乳化現(xiàn)象,則去除上層正己烷后于70水浴10-20min,重復(fù)離心)

                            50µl下層用于分析。

                            樣本稀釋倍數(shù):  2

                            b)蜂蜜樣本處理方法

                            2±0.05g的均質(zhì)物(蜂蜜),分別加入4ml的蒸餾水,0.5ml 1M HCl溶液和100µl衍生化試劑,充分振蕩2min

                            37過夜孵育(大約16h)或56水浴中孵育(2h)

                            分別加入5ml 0.1M K2HPO4溶液,0.4ml 1M NaOH溶液和6ml乙酸乙酯,充分振蕩30s

                            在室溫下(20-254000r/min以上離心10min如出現(xiàn)乳化現(xiàn)象或乙酸乙酯層不足 3ml ,在 80  水浴孵育樣品10min 并重復(fù)離心;或提高轉(zhuǎn)速和延長離心時間重復(fù)離心);

                            取出3ml的乙酸乙酯到另一個容器中于50氮?dú)?/span>/空氣吹干

                            2ml正己烷溶解干燥物,再加入1ml樣本復(fù)溶液充分混合30s;在室溫下4000r/min以上離心10min;去除上層正己烷相(如出現(xiàn)乳化現(xiàn)象,則去除上層正己烷后于70水浴10-20min,重復(fù)離心)

                            50µl下層用于分析。

                            樣本稀釋倍數(shù):  1

                            六、 酶標(biāo)免疫分析程序:

                            測定前應(yīng)須知:

                            1、 使用前將需用試劑和板條的溫度回升至室溫(2025)。

                            2、 使用之后立即將所有試劑放回28

                            3、 ELISA分析中的再現(xiàn)性,很大程度上取決于洗板的一致性,正確的洗板操作是ELISA測定程序中的要點(diǎn)。

                            4、 所有恒溫孵育過程,避免光線照射,用蓋板膜蓋住微孔板。

                            操作步驟:

                            1、 28冷藏環(huán)境中取出所需試劑,室溫(2025)平衡30min以上,注意每種液體試劑使用前均須搖勻。

                            2、 取出框架及需要數(shù)量的微孔,將不用的微孔放入自封袋,保存于2-8

                            3、 配液40ml濃縮洗滌液(20倍濃縮)用去離子水按照119稀釋(1份濃縮洗滌液+19份去離子水),或按所需用量配制洗滌液

                            4、 編號:將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)微孔按序編號,每個樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行,并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置。

                            5、 加標(biāo)準(zhǔn)品/樣品50µl/孔到各自的微孔中,加入酶標(biāo)記物50µl/孔,然后再加入抗體工作液50µl/孔,用蓋板膜封板,25環(huán)境中反應(yīng)30min

                            6、 將孔內(nèi)液體甩干,用已稀釋的洗滌液250µl/孔洗板45次,每次間隔1530秒,用吸水紙拍干(拍干后未清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破)。

                            7、 顯色:加入底物A50µl/孔,再加入底物B50µl/孔,輕輕振蕩混勻,25環(huán)境中避光顯色15min

                            8、 測定:加入終止液50µl/孔,輕輕振蕩混勻,設(shè)定酶標(biāo)儀于450nm處(建議用雙波長450/630nm檢測,5min內(nèi)讀數(shù)),測定每孔OD值。

                            七、結(jié)果判定

                            結(jié)果判定有兩種方法,粗略判定可用第1種方法,定量判定用第2種方法。注意樣本吸光度值與其所含呋喃唑酮代謝物量成負(fù)相關(guān)。

                            1、粗略判定:

                            用樣本的平均吸光度值與標(biāo)準(zhǔn)液吸光度值比較即可得出其濃度范圍(ng/ml)。假設(shè)樣本1的吸光度值為0.3,樣本2的吸光度值為1.0,標(biāo)準(zhǔn)液吸光度值分別是:0ppb2.2430.01ppb1.8160.03ppb1.4150.09ppb0.740.27ppb0.3130.81ppb0.155。則樣本1的濃度范圍是0.27ppb0.81ppb;樣本2的濃度范圍是0.03ppb0.09ppb,乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中呋喃唑酮代謝物實(shí)際濃度。

                            2、定量分析

                            1)百分吸光率的計(jì)算,標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的吸光度值的平均值(雙孔)除以第一個標(biāo)準(zhǔn)(0標(biāo)準(zhǔn))的吸光度值,再乘以100%,即

                            百分吸光%)=

                            B

                            ×100%

                            B0

                            B—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值

                            B0—0ng/ml標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值

                            2)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與計(jì)算

                            以標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率為縱坐標(biāo),以呋喃唑酮代謝物標(biāo)準(zhǔn)品濃ng/ml)的半對數(shù)為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中,從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對應(yīng)的濃度,乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中呋喃唑酮代謝物實(shí)際濃度。

                            若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進(jìn)行計(jì)算,更便于大量樣本的準(zhǔn)確、快速分析。(歡迎來電索取)

                            八、 注意事項(xiàng)

                            1、 室溫低于25或試劑及標(biāo)本未回到室溫(2025)會導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的OD值偏低。

                            2、 在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況,則會伴隨著標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性,重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作。

                            3、 混合要均勻,否則會出現(xiàn)重復(fù)性不好的現(xiàn)象。

                            4、 反應(yīng)終止液為2M硫酸,避免接觸皮膚。

                            5、 不要使用過了有效日期的試劑盒;稀釋或攙雜使用會引起靈敏度、OD值變化;不要交換使用不同批號的盒中試劑。

                            6、 不用的微孔板放進(jìn)自封袋重新密封;標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和無色的發(fā)色劑對光敏感,因此要避免直接暴露在光線下。

                            7、 顯色液若有任何顏色表明變質(zhì),應(yīng)當(dāng)棄之。標(biāo)準(zhǔn)品1的吸光度值小于0.5時,表示試劑可能變質(zhì)。

                            8、 該試劑盒最佳反應(yīng)溫度為25,溫度過高或過低將導(dǎo)致檢測吸光度值和靈敏度發(fā)生變化。

                            九、儲藏條件和保質(zhì)期

                            1、 儲藏條件:試劑盒于28保存,不要冷凍。

                            2、  質(zhì) 期:該產(chǎn)品有效期為1年,生產(chǎn)日期見包裝盒。

                            提示:酶標(biāo)板真空包裝袋若有漏氣,酶標(biāo)板仍然正常有效,不影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果,請放心使用。

                             

                            實(shí)驗(yàn)代做服務(wù):

                            ELISA試劑盒免費(fèi)代檢測

                            CCK8檢測

                            HE染色

                            蛋白相互作用分析

                            Western Blot

                            免疫組化IHC染色

                            熒光定量PCR

                            動物模型服務(wù)

                            流式細(xì)胞檢測

                            免疫熒光染色

                            激光共聚焦

                            DNA甲基化實(shí)驗(yàn)

                            石蠟/冰凍切片

                            透射電鏡服務(wù)

                            掃描電鏡實(shí)驗(yàn)

                            蛋白雙向(2-D)

                            動物實(shí)驗(yàn)

                            免疫共沉淀

                            原位雜交(FIsh

                            蛋白質(zhì)純化

                            分子克隆和質(zhì)粒載體構(gòu)建服務(wù)

                            組蛋白甲基化磷酸化乙酰化

                             

                            蛋白雙向2D-WB

                             

                            藥理毒理動物實(shí)驗(yàn)

                             

                            番紅O固綠染色

                            明膠酶譜MMP

                            酶活性檢測

                            動物造模/模型實(shí)驗(yàn)服務(wù)

                            滬公網(wǎng)安備 31011802001677號

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