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                            網(wǎng)站首頁技術(shù)中心 > 兔腫瘤組織巨噬細(xì)胞分離液KIT說明書
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                            兔腫瘤組織巨噬細(xì)胞分離液KIT說明書
                            更新時(shí)間:2015-12-15 點(diǎn)擊量:775

                             

                            兔腫瘤組織巨噬細(xì)胞分離液KIT說明書實(shí)驗(yàn)方法

                             

                            【產(chǎn)品規(guī)格】

                             

                            2×200ml/Kit

                             

                            【產(chǎn)品組成】

                             

                            為方便廣大用戶使用,試劑內(nèi)容如下:

                             

                             

                             

                             

                             

                            名稱

                             

                            產(chǎn)品編號(hào)

                            規(guī)格

                             

                             

                             

                             

                             

                             

                             

                             

                             

                             

                             

                            A

                            試劑 A

                             

                             

                             

                            200ml

                             

                             

                             

                             

                             

                             

                             

                             

                             

                             

                             

                            B

                            試劑 C

                             

                             

                             

                            200ml

                             

                             

                             

                             

                             

                             

                             

                             

                             

                             

                             

                            C

                            樣本稀釋液(贈(zèng)品)

                             

                            2010C1119

                            200ml

                             

                             

                             

                             

                             

                             

                             

                             

                             

                             

                             

                            D

                            清洗液(贈(zèng)品)

                             

                            2010X1118

                            200ml

                             

                             

                             

                             

                             

                             

                             

                             

                             

                             

                             

                            E

                            F 液(贈(zèng)品)

                             

                            F2013TBD

                            200ml

                             

                             

                             

                             

                             

                             

                             

                             

                             

                             

                             

                            F

                            說明書

                             

                             

                             

                            1

                             

                             

                             

                             

                             

                             

                             

                             

                             

                             

                            【實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備】

                             

                             

                             

                             

                             

                            A 適用儀器

                             

                             

                             

                             

                             

                             

                            zui大離心力可達(dá) 1200g 的水平轉(zhuǎn)子離心機(jī)

                             

                             

                             

                             

                            B 耗材

                             

                             

                             

                             

                             

                             

                             

                             

                             

                             

                             

                             

                             

                             

                             

                             

                            產(chǎn)品名稱

                             

                            產(chǎn)品貨號(hào)

                             

                            產(chǎn)地

                             

                             

                             

                             

                             

                             

                             

                             

                             

                             

                             

                            15ml 離心管散裝

                             

                            339650

                             

                            美國 NUNC

                             

                             

                             

                             

                             

                             

                             

                             

                             

                             

                             

                            15ml 離心管架裝

                             

                            339651

                             

                            美國 NUNC

                             

                             

                             

                             

                             

                             

                             

                             

                             

                             

                             

                            50ml 離心管散裝

                             

                            339652

                             

                            美國 NUNC

                             

                             

                             

                             

                             

                             

                             

                             

                             

                             

                             

                            50ml 離心管架裝

                             

                            339653

                             

                            美國 NUNC

                             

                             

                             

                             

                             

                             

                             

                             

                             

                             

                             

                            無菌膠頭滴管或塑料滴管

                             

                             

                             

                             

                             

                             

                             

                             

                             

                             

                             

                             

                             

                             

                            【檢驗(yàn)方法】

                             

                             

                             

                             

                             

                             

                            全過程樣本、試劑及實(shí)驗(yàn)環(huán)境均需在 20±2的條件下進(jìn)行。

                             

                            1. 首先制備組織單細(xì)胞懸液,制備方法詳見“組織單細(xì)胞懸液制備技術(shù)”。

                             

                            1. 取一支 15ml 離心管,先加入 3ml 試劑 A 后加入 2ml 試劑 C,制成梯度界面。

                             

                            1. 用吸管小心吸取組織單細(xì)胞懸液加于分離液液面上,400-550g,離心 20-30min。(注: 根據(jù)組織單細(xì)胞懸液量確定離心條件,組織單細(xì)胞懸液量越大,離心力越大,離心時(shí)間 越長,具體離心條件需客戶自行摸索,以達(dá)到分離效果)。

                             

                             

                            1. 離心后,此時(shí)離心管中將出現(xiàn)兩層環(huán)狀乳白色細(xì)胞層。

                             

                            1. 用吸管小心吸取上層環(huán)狀乳白色目的細(xì)胞層到另一 15ml 離心管中,向離心管中加入 10ml 清洗液(產(chǎn)品編號(hào):2010X1118),混勻細(xì)胞。

                             

                            1. 250g,離心 10min

                             

                            1. 棄上清。

                             

                            1. 用吸管以 5ml 清洗液(產(chǎn)品編號(hào):2010X1118)重懸所得細(xì)胞。

                             

                            1. 250g,離心 10min

                             

                            1. 重復(fù) 789,棄上清后以 0.5ml 后續(xù)實(shí)驗(yàn)所需相應(yīng)液體重懸細(xì)胞。

                             

                            1. 差異貼壁法純化細(xì)胞 (1)用巨噬細(xì)胞無血清培養(yǎng)基(產(chǎn)品編號(hào):CTBD2015MAC)或巨噬細(xì)胞*培養(yǎng)基 (產(chǎn)品編號(hào):HCTBD2015MAC)以 1.5-3×106 個(gè)/ml 的密度重懸細(xì)胞,將細(xì)胞鋪于一次 性細(xì)胞板或細(xì)胞瓶中,放于 37二氧化碳培養(yǎng)箱中進(jìn)行貼壁培養(yǎng)。

                             

                            22-4 小時(shí)內(nèi)貼壁的為巨噬細(xì)胞前體(俗稱為單核細(xì)胞)。 (310-24 小時(shí)內(nèi)貼壁的單個(gè)核細(xì)胞為內(nèi)皮、內(nèi)皮祖細(xì)胞、干細(xì)胞。 (4)不貼壁的為淋巴細(xì)胞。

                             

                            注:

                             

                            1. 無血清培養(yǎng)基中不含任何動(dòng)物成分,為得到更佳培養(yǎng)效果可添加 10%自體血漿或 2-8% 經(jīng)篩選的胎牛血清。

                             

                            1. *培養(yǎng)基中含 2-20%胎牛血清(血清具體含量由所培養(yǎng)的目的細(xì)胞而定)。

                             

                            1. 由于每種細(xì)胞的貼壁時(shí)間存在差異可將所得細(xì)胞分開已達(dá)簡單的純化目的,此法成

                             

                            本相對(duì)較低。如需獲得高純度目的細(xì)胞則需在使用分離液后選用免疫磁珠陽性或陰

                             

                            性分選。

                             

                            【注意事項(xiàng)】

                             

                            1. 全過程樣本、試劑及實(shí)驗(yàn)環(huán)境均需在 20±2的條件下進(jìn)行。為獲得的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,zui 好在取樣 2h 內(nèi)進(jìn)行實(shí)驗(yàn),樣品存放時(shí)間越長,細(xì)胞分離效果越差。樣品放置超過 6h 后 分離效果更差甚至不能達(dá)到分離目的。

                             

                            1. 本實(shí)驗(yàn)不要使用高聚合材質(zhì)(如聚苯乙烯)的塑料制品,應(yīng)使用無靜電、低靜電離 心管及未經(jīng)堿處理過后的玻璃制品,因?yàn)殪o電作用將導(dǎo)致細(xì)胞貼壁、堿處理的玻璃表面 會(huì)變成毛面,影響細(xì)胞分離效果。

                             

                            1. 吸取過多的乳白色細(xì)胞層及分離液層會(huì)導(dǎo)致分離液交界處的粒細(xì)胞被吸出從而使混雜的

                             

                             

                             

                            粒細(xì)胞數(shù)量增加。

                             

                            1. 分離液用量大于組織單細(xì)胞懸液樣本時(shí),分離效果更佳。

                             

                            1. 如實(shí)驗(yàn)后細(xì)胞得率或活性過低,請(qǐng)以尋求幫助,具體詳 見下方生產(chǎn)企業(yè)信息。

                             

                            【儲(chǔ)存條件及有效期】

                             

                            18-25保存,有效期 2 年。本品易感染細(xì)菌,需無菌條件操作。無菌條件下操作,啟

                             

                            封后置常溫保存。如 4保存,本分離液易出現(xiàn)白色結(jié)晶,影響分離效果。

                             

                            【參考值(參考范圍)】

                             

                            本實(shí)驗(yàn)巨噬細(xì)胞提取率大于 80%

                             

                            下表為成年人外周血中各種細(xì)胞的數(shù)量及比例,用戶可適當(dāng)進(jìn)行參考。

                             

                             

                            紅細(xì)胞

                             

                            白細(xì)胞

                             

                            血小板

                             

                             

                             

                             

                             

                             

                             

                             

                            4.0-10.0)×109

                             

                            含量(個(gè)/L

                            4.0-5.5)×1012

                            中性粒細(xì)胞

                            淋巴細(xì)胞

                            單核細(xì)胞

                            1.0-3.0)×1011

                             

                             

                            50%-70%

                            20%-40%

                            3%-8%

                             

                             

                             

                             

                             

                             

                             

                             

                            【相關(guān)實(shí)驗(yàn)技術(shù)方案】

                             

                            1. 組織單細(xì)胞懸液制備技術(shù)。

                             

                            1. 所獲得巨噬細(xì)胞的培養(yǎng)技術(shù)。

                             

                            1. 所獲得巨噬細(xì)胞的核酸提取技術(shù)。

                             

                            1. 所獲得巨噬細(xì)胞的鑒定方法 A.流式細(xì)胞技術(shù) B.免疫組化技術(shù) C.原位雜交技術(shù)

                             

                            D.PCR 技術(shù)

                             

                            注:上述技術(shù)方案詳情請(qǐng)登陸本搜索細(xì)胞分離、

                             

                            純化、擴(kuò)增、鑒定及生物治療技術(shù)手冊(cè),并在說明書項(xiàng)目欄下下載使用。

                             

                            【可能存在的問題及解決方法】

                             

                            1.    由于血液粘度、細(xì)胞密度等差異可能造成的問題及解決方案如下表所示:

                             

                            出現(xiàn)情況

                            出現(xiàn)原因

                             

                            建議解決方案

                             

                             

                             

                             

                             

                            離心后目的細(xì)胞存在于血漿層或稀釋液層

                            轉(zhuǎn)速過小或離心時(shí)間過短

                            適當(dāng)增減轉(zhuǎn)速

                             

                             

                             

                             

                             

                            離心后目的細(xì)胞存在于分離液中

                            轉(zhuǎn)速過大或離心時(shí)間過長

                             

                             

                             

                             

                             

                             

                             

                             

                             

                             

                             

                             

                             

                             

                             

                             

                            離心后白環(huán)層彌散

                            細(xì)胞密度過大

                            調(diào)整細(xì)胞密度

                             

                             

                             

                             

                            離心后白環(huán)層太淺或看不見

                            細(xì)胞密度過小

                             

                             

                             

                             

                             

                             

                             

                            1. 本分離液分離細(xì)胞的原理為密度梯度離心,其密度與溫度、大氣壓等密切相關(guān)。不同地 區(qū)客戶可根據(jù)當(dāng)?shù)厍闆r對(duì)離心條件進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。建議對(duì)離心條件進(jìn)行調(diào)整時(shí),恒定離 心時(shí)間,對(duì)離心轉(zhuǎn)速進(jìn)行調(diào)整。

                             

                            1. 本分離液依照標(biāo)準(zhǔn),全部使用藥用級(jí)原料,性能指標(biāo)與國產(chǎn)同類產(chǎn)品略有不同,可 能出現(xiàn)紅細(xì)胞沉降不*的情況,可以適當(dāng)加大離心轉(zhuǎn)速。

                             

                            注:在對(duì)離心條件進(jìn)行調(diào)整時(shí),離心轉(zhuǎn)速的加減以 50-100g 為基數(shù),直至達(dá)到分離效果,

                             

                            離心力zui小不得小于 400g,zui大不得大于 1200g。離心時(shí)間以 20-30min 為準(zhǔn)。

                            滬公網(wǎng)安備 31011802001677號(hào)

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